轉基因植物安全評價指南（試行）

轉基因植物安全評價指南（試行）
農業部
2009年12月31日

轉基因植物安全評價指南（試行）

一、總體要求 　　（一）分子特徵

　　從基因水平、轉錄水平和翻譯水平，考察外源插入片段的整合和表達情況。

　　1. 表達載體相關資料

　　（1）目的基因與載體構建的物理圖譜

　　詳細註明表達載體所有元件名稱、位置和酶切位點。

　　（2）目的基因

　　詳細描述目的基因的供體生物、結構（包括基因中的酶切位點）、功能和安全性。 　　供體生物：如Bt基因cry1A來源於蘇雲金芽孢桿菌XX菌株。 　　結構：完整的DNA序列和推導的氨基酸序列。 　　功能：生物學性狀，如抗鱗翅目昆蟲。 　　安全性：從供體生物特性、安全使用歷史、基因結構、功能及有關安全性試驗數據等方面綜合評價目的基因的安全性。

　　（3）表達載體其他主要元件

　　啟動子：供體生物來源、大小、DNA序列（或文獻）、功能、安全應用記錄。 　　終止子：供體生物來源、大小、DNA序列（或文獻）、功能、安全應用記錄。 　　標記基因：供體生物來源、大小、DNA序列（或文獻）、功能、安全應用記錄。 　　報告基因：供體生物來源、大小、DNA序列（或文獻）、功能、安全應用記錄。 　　其他表達調控序列：來源（如人工合成或供體生物名稱）、名稱、大小、DNA序列（或文獻）、功能、安全應用記錄。

　　2. 目的基因在植物基因組中的整合情況

　　採用PCR、Southern雜交等方法，分析外源插入片段在植物基因組中的整合情況，包括目的基因和標記基因的拷貝數，標記基因、報告基因或其它調控序列刪除情況，整合位點等。 　　外源插入片段的PCR檢測：片段名稱、引物序列、擴增產物長度、PCR條件、擴增產物電泳圖譜（含圖題、分子量標準、陰性對照、陽性對照、泳道標註）。 　　外源插入片段的Southern雜交：植物基因組總DNA限制性酶切，提供兩種以上能明確整合拷貝數的、具有特異性雜交條帶的限制性內切酶圖譜。文字描述至少包括探針序列位置、內切酶名稱、特異性條帶的大小、圖題、分子量標準、陰性對照、陽性對照、泳道標註。 　　外源插入片段的全長DNA序列：實際插入受體植物基因組的全長DNA序列和插入位點的兩端邊界序列。提供PCR驗證時相應引物名稱、序列及其擴增產物長度。

　　3. 外源插入片段的表達情況

　　（1）轉錄水平表達（RNA） 　　採用RT－PCR或Northern雜交等方法，分析主要插入序列（如目的基因、標記基因等）的轉錄表達情況，包括表達的主要組織和器官（如根、莖、葉、種子等）。 RT－PCR檢測：引物序列、擴增產物長度、RT-PCR條件、擴增產物電泳圖譜（含圖題、分子量標準、陰性對照、陽性對照、泳道標註）。 　　Northern雜交：探針序列位置、特異性條帶的大小、Northern雜交條件、雜交圖譜（含圖題、分子量標準、陰性對照、陽性對照、泳道標註）。

　　（2）翻譯水平表達（蛋白質） 　　採用ELISA或Western雜交等方法，分析主要插入序列（如目的基因、標記基因等）的蛋白質表達情況，包括表達的主要組織和器官（如根、莖、葉、種子等）。 ELISA檢測：描述定量檢測的具體方法，包括相關抗體、陰性對照、陽性對照、光密度測定結果、標準曲線等。 　　Western雜交：相關抗體名稱、特異性條帶的大小、Western雜交條件、雜交圖譜（含圖題、分子量標準、陰性對照、陽性對照、泳道標註、樣品和陽性對照的加樣量）。

　　（二）遺傳穩定性

　　主要考察轉基因植物代際間目的基因整合與表達情況。 　　1. 目的基因整合的穩定性 　　用Southern或PCR手段檢測目的基因在轉化體中的整合情況，明確轉化體中目的基因的拷貝數以及在後代中的分離情況，提供不少於3代的試驗數據。 　　2. 目的基因表達的穩定性

   用Northern，RT-PCR, Western等手段提供目的基因在转化体不同世代在转录（RNA）和（或）翻译（蛋白质）水平表达的稳定性（包括不同发育阶段和不同器官部位的表达情况），提供不少于3代的试验数据。

　　3. 目標性狀表現的穩定性 　　用適宜的觀察手段考察目標性狀在轉化體不同世代的表現情況，提供不少於3代的試驗數據。

　　（三）環境安全

　　1. 生存競爭能力 　　提供在自然環境下，轉基因植物與受體關於種子活力、種子休眠特性、越冬越夏能力、抗病蟲能力、生長勢、生育期、產量、落粒性等適合度變化與雜草化風險評估等的試驗數據和結論。 若受體植物為多年生草類（飼草、制種用的草坪草）或目標性狀增強生存競爭力（如抗旱、耐鹽等），應根據個案分析的原則提出有針對性的補充資料。 　　2. 基因漂移的環境影響 　　（1）受體物種的相關資料 　　如果存在可交配的野生近緣種，提供野生近緣種的地理分布範圍、發生頻率、生物學特性（生育期、生長習性、開花期、繁殖習性、種子及無性繁殖器官的傳播途徑等）以及與野生近緣種的親緣關係（包括基因組類型、與栽培種的天然異交結實性（%）、雜種F1的育性及其後代的生存能力和結實能力）的資料。 　　如果存在同一物種的可交配植物類型，需提供同一物種植物類型的分布及其危害情況。 　　（2）外源基因漂移風險 　　對於存在可交配的野生近緣種或存在同一物種可交配的植物類型，又無相關數據和資料的，可設計試驗評估外源基因漂移風險及可能造成的生態後果，如基因漂移頻率、外源基因在野生近緣種中表達情況、目的基因是否改變野生近緣種的生態適合度等。 　　3. 轉基因植物的功能效率評價 　　提供自然條件下轉基因植物的功能效率評價報告。如為有害生物抗性轉基因植物，則需要提供對靶標生物的抗性效率試驗數據。 　　抗性效率指抗有害生物轉基因植物所產生的抗性物質對靶標生物綜合作用的結果，一般通過轉基因品種與受體品種在靶標生物數量變化、危害程度、植物長勢及產量等方面的差別進行評價。抗病蟲轉基因植物需提供在室內和田間試驗條件下，轉基因植物對靶標生物的抗性生測報告、靶標生物在轉基因及受體品種田季節性發生危害情況和種群動態的試驗數據與結論。 　　4. 有害生物抗性轉基因植物對非靶標生物的影響 　　根據轉基因植物與外源基因表達蛋白特點和作用機制，有選擇地提供對相關非靶標植食性生物、有益生物（如天敵昆蟲、資源昆蟲和傳粉昆蟲等）、受保護的物種等其它非靶標生物潛在影響的評估報告。 　　5. 對植物生態系統群落結構和有害生物地位演化的影響 　　根據轉基因植物與外源基因表達蛋白的特異性和作用機理，有選擇地提供對相關動物群落、植物群落和微生物群落結構和多樣性的影響，以及轉基因植物生態系統下病蟲害等有害生物地位演化的風險評估報告等。 　　6.　靶標生物的抗性風險 　　靶標生物的抗性是指靶標生物由於連續多代取食轉基因植物，敏感個體被淘汰，抗性較強的個體存活、繁殖、逐漸發展成高抗性種群的現象。抗病蟲害轉基因植物需提供對靶標生物的作用機制和特點等資料，轉基因植物商業化種植前靶標生物的敏感性基線數據，抗性風險評估依據和結論，擬採取的抗性監測方案和治理措施等。

　　（四）食用安全

　　按照個案分析的原則，評價轉基因植物與非轉基因植物的相對安全性。 　　傳統非轉基因對照物選擇：無性繁殖的轉基因植物，以非轉基因植物親本為對照物；有性繁殖的轉基因植物，以遺傳背景與轉基因植物有可比性的非轉基因植物為對照物。對照物與轉基因植物的種植環境（時間和地點）應具有可比性。 　　1. 新表達物質毒理學評價 　　（1）新表達蛋白資料 　　提供新表達蛋白質（包括目標基因和標記基因所表達的蛋白質）的分子和生化特徵等信息，包括分子量、氨基酸序列、翻譯後的修飾、功能敘述等資料。表達的產物若為酶，應提供酶活性、酶活性影響因素（如pH、溫度、離子強度）、底物特異性、反應產物等。 　　提供新表達蛋白質與已知毒蛋白質和抗營養因子（如蛋白酶抑制劑、植物凝集素等）氨基酸序列相似性比較的資料。 　　提供新表達蛋白質熱穩定性試驗資料，體外模擬胃液蛋白消化穩定性試驗資料，必要時提供加工過程（熱、加工方式）對其影響的資料。 　　若用體外表達的蛋白質作為安全性評價的試驗材料，需提供體外表達蛋白質與植物中新表達蛋白質等同性分析（如分子量、蛋白測序、免疫原性、蛋白活性等）的資料。 　　（2）新表達蛋白毒理學試驗 　　當新表達蛋白質無安全食用歷史，安全性資料不足時，必須提供急性經口毒性資料，28天餵養試驗毒理學資料視該蛋白質在植物中的表達水平和人群可能攝入水平而定，必要時應進行免疫毒性檢測評價。如果不提供新表達蛋白質的經口急性毒性和28天餵養試驗資料，則應說明理由。 　　（3）新表達非蛋白質物質的評價 　　新表達的物質為非蛋白質，如脂肪、碳水化合物、核酸、維生素及其它成分等，其毒理學評價可能包括毒物代謝動力學、遺傳毒性、亞慢性毒性、慢性毒性/致癌性、生殖發育毒性等方面。具體需進行哪些毒理學試驗，採取個案分析的原則。 　　（4）攝入量估算 　　應提供外源基因表達物質在植物可食部位的表達量，根據典型人群的食物消費量，估算人群最大可能攝入水平，包括同類轉基因植物總的攝入水平、攝入頻率等信息。進行攝入量評估時需考慮加工過程對轉基因表達物質含量的影響，並應提供表達蛋白質的測定方法。

　　2. 致敏性評價 　　外源基因插入產生新蛋白質，或改變代謝途徑產生新蛋白質的，應對其蛋白質的致敏性進行評價。 　　提供基因供體是否含有致敏原、插入基因是否編碼致敏原、新蛋白質在植物食用和飼用部位表達量的資料。 　　提供新表達蛋白質與已知致敏原氨基酸序列的同源性分析比較資料。 　　提供新表達蛋白質熱穩定性試驗資料，體外模擬胃液蛋白消化穩定性試驗資料。 　　對於供體含有致敏原的，或新蛋白質與已知致敏原具有序列同源性的，應提供與已知致敏原為抗體的血清學試驗資料。 　　受體植物本身含有致敏原的，應提供致敏原成分含量分析的資料。

　　3. 關鍵成分分析 　　提供受試物基本信息，包括名稱、來源、所轉基因和轉基因性狀、種植時間、地點和特異氣候條件、儲藏條件等資料。受試物應為轉基因植物可食部位的初級農產品，如大豆、玉米、棉籽、水稻種子等。同一種植地點至少三批不同種植時間的樣品，或三個不同種植地點的樣品。 提供同一物種對照物各關鍵成分的天然變異閥值及文獻資料等。 　　（1）營養素。包括蛋白質、脂肪、碳水化合物、纖維素、礦物質、維生素等，必要時提供蛋白質中氨基酸和脂肪中飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸含量分析的資料。礦物質和維生素的測定應選擇在該植物中具有顯著營養意義或對人群營養素攝入水平貢獻較大的礦物質和維生素進行測定。 　　（2）天然毒素及有害物質。植物中對健康可能有影響的天然存在的有害物質，根據不同植物進行不同的毒素分析，如棉籽中棉酚、油菜籽中硫代葡萄糖甙和芥酸等。 　　（3）抗營養因子。對營養素的吸收和利用有影響、對消化酶有抑制作用的一類物質。如大豆胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、大豆寡糖等；玉米中植酸；油菜籽中單寧等。 　　（4）其他成分。如水分、灰分、植物中的其他固有成分 　　（5）非預期成分。因轉入外源基因可能產生的新成分。

　　4. 全食品安全性評價 　　大鼠90天餵養試驗資料。必要時提供大鼠慢性毒性試驗和生殖毒性試驗及其他動物餵養試驗資料。

　　5. 營養學評價 　　如果轉基因植物在營養、生理作用等方面有改變的，應提供營養學評價資料。 　　（1）提供動物體內主要營養素的吸收利用資料。 　　（2）提供人群營養素攝入水平的資料以及最大可能攝入水平對人群膳食模式影響評估的資料。

　　6. 生產加工對安全性影響的評價 　　應提供與非轉基因對照物相比，生產加工、儲存過程是否可改變轉基因植物產品特性的資料，包括加工過程對轉入DNA和蛋白質的降解、消除、變性等影響的資料，如油的提取和精煉、微生物發酵、轉基因植物產品的加工、儲藏等對植物中表達蛋白含量的影響。

　　7. 按個案分析的原則需要進行的其它安全性評價 　　對關鍵成分有明顯改變的轉基因植物，需提供其改變對食用安全性和營養學評價資料。

　　二、階段要求

　　以下規定是申請該階段時所需材料的基本要求。

　　（一）申請中間試驗 　　1. 提供外源插入序列的分子特徵資料。 　　2. 提供每一個轉化體的轉基因植株自交或雜交代別及目的基因和標記基因PCR檢測的資料。 　　3. 按《轉基因植物及其產品食用安全評價導則》（NY/T1101-2006）提供受體植物、基因供體生物的安全性評價資料。 　　4. 提供新表達蛋白質的分子和生化特徵等信息，以及提供新表達蛋白質與已知毒蛋白質和抗營養因子氨基酸序列相似性比較的資料。 　　5. 提供抗蟲植物表達蛋白質和已商業化種植的轉基因抗蟲植物對靶標害蟲作用機制的分析資料，評估交互抗性的風險。

　　（二）申請環境釋放 　　1. 申請中間試驗提供的相關資料，以及中間試驗結果的總結報告。 　　2. 提供每個轉基因株系中目的基因的PCR檢測圖，並註明轉基因株系的代別和編號。 　　3. 提供每個轉基因株系中目的基因和標記基因整合進植物基因組的Southern雜交圖和插入拷貝數，並註明轉基因株系的代別和編號。 　　4. 提供目的基因在轉錄水平或翻譯水平表達的資料。 　　5. 提供轉基因株系遺傳穩定性的資料，包括目的基因和標記基因整合的穩定性、表達的穩定性和表型性狀的穩定性。 　　6. 抗病蟲轉基因植物，提供目標蛋白的測定方法，植物不同發育階段目標蛋白在各器官中的含量，以及對靶標生物的田間抗性效率。 　　7. 新蛋白質（包括目標基因和標記基因所表達的蛋白質）在植物食用和飼用部位表達含量的資料。 　　8. 提供靶標害蟲對新抗蟲植物和已商業化種植的抗蟲植物交互抗性的研究資料。 　　9. 提供對可能影響的非靶標生物的室內生物測定資料。 　　10. 提供目標性狀和功能的評價資料。如，抗蟲植物應明確靶標生物種類並提供室內或田間生測報告。

　　（三）申請生產性試驗 　　1. 申請環境釋放提供的相關資料，以及環境釋放結果的總結報告。 　　2. 提供轉化體外源插入片段（如目的基因和標記基因等）整合進植物基因組的PCR檢測圖、Southern雜交圖和插入拷貝數，並註明供試材料的名稱和代別。 　　3. 提供目的基因和標記基因翻譯水平表達的資料，或目標基因（被RNAi等方法所干涉的基因）在轉錄水平或翻譯水平表達的資料。 　　4. 提供該轉化體遺傳穩定性至少2代的資料，包括目的基因整合的穩定性、表達的穩定性和表現性狀的穩定性。 　　5. 提供該轉化體個體生存競爭能力的資料。 　　6. 提供該轉基因植物基因漂移的資料。 　　7. 提供目標性狀和功能的評價資料。如，抗蟲植物應提供田間試驗條件下，靶標生物在轉基因及受體品種田季節性發生危害情況和種群動態的試驗數據。 　　8. 提供靶標生物對抗病蟲轉基因植物的抗性風險評價資料。 　　9. 提供對非靶標生物和生物多樣性影響的評價資料。 　　10. 提供新表達蛋白質體外模擬胃液蛋白消化穩定性試驗資料。 　　11. 必要時提供全食品毒理學評價資料。

　　（四）申請安全證書 　　1. 匯總以往各試驗階段的資料，提交環境安全和食用安全綜合評價報告。 　　2. 提供外源片段的全長DNA序列和插入位點的兩端邊界序列。 　　3. 提供該轉化體遺傳穩定性至少3代的資料，包括目的基因整合的遺傳穩定性、表達的穩定性和表現性狀的穩定性。 　　4. 提供該轉化體個體生存競爭能力、自然延續或建立種群能力的資料。 　　5. 提供該轉基因植物基因漂移的資料。 　　6. 提供至少2年對目標性狀和功能的田間評價資料。 　　7. 提供靶標生物對轉基因植物所產生抗病/蟲物質的敏感性基線資料，抗性風險評估的依據和結論；擬採取的靶標生物綜合治理策略、抗性監測方案和治理措施等。 　　8. 提供至少2年對非靶標生物和生物多樣性影響的評價資料，以及轉基因植物生態系統下病蟲害地位演化的風險評估報告。 　　9. 提供完整的毒性、致敏性、營養成分、抗營養因子等食用安全資料。 　　10. 如為續申請，則需要提供上次批准期限內的商業化種植數據和環境影響監測報告。

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