麝香保心丸對老年痴呆症和炎症作用的研究
| 麝香保心丸對老年痴呆症和炎症作用的研究 作者：夏英傑 許勵 鄭鍾毓 詹常森 商曉慧 董婷霞 胡偉慧 陳嘉豪 段然 詹華強 2019年9月1日 |
文章引用：夏英傑，許勵，鄭鍾毓，等．麝香保心丸對老年痴呆症和炎症作用的研究［J］．藥學研究，2019，1（1）：1-14．https://doi.org/10.35534/rp.0101001
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麝香保心丸對老年痴呆症和炎症
作用的研究
夏英傑 1,2 許 勵 1,2 鄭鍾毓 1,2 詹常森 3 商曉慧 3
董婷霞 1,2 胡偉慧 1,2 陳嘉豪 1,2 段 然 1,2 詹華強 1,2*
1. 香港科技大學深圳研究院，深圳市食用和藥用生物資源重點實驗室，深圳；
2. 香港科技大學生命科學學院，香港；
3. 上海和黃藥業有限公司，上海
郵箱：botsim@ust.hk
摘要：目的：探究不同前處理的麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill，SBP）的神經保護作用及抗炎反應。方法：本研究利用神經生長因子誘導 PC12 細胞分化建立軸突生長模型，利用脂多糖誘導 RAW264.7 細胞建立炎症模型。用不同前處理方式得到 SBP 藥液，通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）法確定最佳給藥劑量。通過形態學分析得到 PC12 軸突長度的變化；MTT 法測定 Aβ1-42 聚集對PC12的細胞毒性；熒光定量 PCR 法測定 SBP 對炎症因子表達的影響。結果：SBP 對神經軸突生長具有促進作用，且可顯著地逆轉由 Aβ1-42 聚集產生的神經毒性作用（p ＜ 0.05）；除人工胃液處理的 SBP 外，其餘 SBP 均可顯著抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素 -6（IL-6）表達水平（p ＜ 0.05）。結論：SBP 具有神經保護潛力，且可以抑制由 LPS 誘導產生的炎症反應。
關鍵詞：麝香保心丸；前處理方法；神經分化；Aβ 聚集；抗炎作用
收稿日期：2019-07-12；錄用日期：2019-07-31；發表日期：2019-09-01
Copyright © 2019 by author(s) and SciScan Publishing Limited
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1 背景
阿爾茲海默症作為一種典型的神經退行性疾病，因其漫長的病理進程及在老年人群中的高發性得到國內外廣泛關注。然而由於神經退行性疾病發病機制的高度複雜性，目前尚未有針對此疾病的特效藥。β 澱粉樣蛋白的異常聚集是目前對神經退行性疾病最廣泛的假說之一［1］［2］。已有研究提出神經退行性疾病的病理生理學改變與神經營養因子有關，如神經生長因子 (Nerve growth factor，NGF) 可促使神經細胞的軸突生長，防止神經退化［3］。同時，神經退行性疾病通常伴有明顯的神經炎症反應，例如老年性痴呆症發作的一個重要原因就是腦神經細胞發生炎症［4］。
麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pill，SBP）是臨床上治療心肌缺血引發的心絞痛、胸悶及心肌梗死等併發症的常用中成藥。近年來，有研究認為 SBP 在治療腦缺血性疾病方面有良好功效［5］。因此本研究旨在探討不同前處理方法下 SBP 對 神經分化、Aβ 聚集導致的神經細胞毒性及炎症反應的影響，初步探索 SBP 的 神經保護潛在作用。
2 材料與方法
2.1 藥物與試劑
三個批次的 SBP 批號分別為：170725、171214 及 180110，均由上海和黃藥 業 有 限 公 司 提 供。 四 噻 唑 藍（Methylthiazoletrazolium，MTT） 購 自 Sigma。Dulbecco 改 良 的 Eagle 培 養 基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胰蛋白酶和磷酸鹽緩衝液（Phosphate-buffer saline，PBS）購自 Gibco。用於細胞培養的胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、馬血清（Horse serum，HS）及其他材料購自 Invitrogen（Carlsbad，CA）。
2.2 方法
2.2.1 SBP 的前處理方法[編輯]
以下為不同前處理方法的 SBP 母液的製備：
SBP 水提液的製備：取不同批次 SBP，研磨成粉，以 1∶8（W ∶V）加入蒸餾水，37 ℃超聲 30 分鐘，收集濾液，剩餘藥粉以 1∶6（W ∶V）加入蒸餾水，37 ℃超聲 30 分鐘，收集濾液，合併兩次濾液並冷凍乾燥，製成 100 mg·mL-1 水提液；SBP 醇提液的製備：取不同批次 SBP，研磨成粉，以 1∶8（W ∶V）加入 95% 乙醇，37 ℃超聲 30 分鐘，收集濾液，剩餘藥粉以 1∶6（W∶V）加入 95% 乙醇，37 ℃超聲 30 分鐘，收集濾液，合併兩次濾液，旋蒸並冷凍乾燥，加入 DMSO 製成 100 mg·mL-1 醇提液 ; 以 DMSO 前處理 SBP：稱取 1 g 各批次 SBP，溶於 2 mL DMSO，超聲 30 分鐘，製成 500 mg·mL-1 藥液（SBP-DMSO）; 以人工胃液前處理 SBP：在 50 mL 人工胃液（Simulated gastric fluid without enzyme, Fluka）中加入 0.16 g 胃蛋白酶（Pepsin），並調節至 pH=1.2，待胃蛋白酶充分溶解後，分別將三個批次 SBP 各稱取 1 g，溶於 10 mL 的人工胃液中，充分渦旋混勻 , 超聲 30 分鐘，最終得到濃度為 100 mg·mL-1 的 SBP 藥液（SBP-SGF）。
2.2.2 細胞培養及給藥方式[編輯]
PC12 細 胞（CRL-1721） 購 自 American Type Culture Collection（ATCC，Manassas，VA）。PC12 細胞置於 DMEM 培養液（含 6% 胎牛血清和馬血清、100 U·mL-1 青黴素及 100 μg·mL-1 鏈黴素），在 37 ℃、7.5%CO2 及飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養。細胞給藥時，PC12 細胞置於低血清 DMEM 培養液（含 1% 胎牛血清和馬血清、100 U·mL-1 青黴素及 100 U·mL-1 鏈黴素）中 3 小時，再置於含有各藥液的低血清 DMEM 培養液中 48 小時。
RAW264.7 細 胞（TIB-71） 購 自 American Type Culture Collection（ATCC，Manassas，VA）。細胞置於 DMEM 培養基（含 10% 胎牛血清、100 U·mL-1 青黴素和 100 μg·mL-1 鏈黴素）中，在 37 ℃、5% CO2 及飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養，隔天傳代。細胞給藥時，先用含不同前處理的 SBP 的完全培養基孵育 5 小時，後加入脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，100 ng·mL-1）誘導炎症反應，繼續培養 12 小時後收集細胞。
本研究中 DMSO 和 SGF 處理細胞時的體積比均控制在 0.1% 以內。
2.2.3 MTT 法測細胞毒性[編輯]
利用 MTT 法進行細胞活力測定以確定每種藥液的安全給藥濃度範圍，確保在該安全濃度範圍內所有藥液均不誘導細胞增殖或死亡。將 PC12 細胞接種到96 孔板，將 SBP 按照一定的濃度梯度處理細胞，48 小時後加入 5 mg·mL-1 的MTT，培養箱中孵育 3 小時，吸走含 MTT 的培養基，加入 DMSO，震盪 15 分鐘後於 570 nm 中測量其吸光度值。
2.2.4 PC12 細胞軸突生長的形態學觀察[編輯]
PC12 細胞以 3×104/mL 接種於 6 孔板中，以培養基為空白對照，NGF（50 ng·mL-1）為陽性對照；以含有或不含低濃度 NGF（1.5 ng·mL-1）的每種藥液處理 PC12 細胞 48 小時，每 24 小時供應新鮮培養基和藥液。光鏡下各組隨機選擇 10 個視野，利用 SPOT 軟件顯微鏡測微尺測量各組分化細胞的細胞軸突長度。若一個或多個神經軸突長於細胞直徑，則該細胞被歸為分化細胞，根據其神經軸突長度分為不同組，即 < 15 μm 組、15-30 μm 組及 > 30 μm 組。
2.2.5 β- 澱粉樣蛋白 42 (Aβ1-42) 聚集和神經毒性測定[編輯]
將終濃度為 10 μmol·L-1 的 Aβ1-42 與各藥液溶於水中，以 30 μmol·L-1薑黃素為陽性對照，在 37 ℃下孵育 4 天。將 10 μL 樣品與 190 μL 硫磺素 T（ThT）溶液（5 μmol·L-1）混合，通過 EnVisionTM Multilabel Reader 測量熒光強度，從而測定 Aβ1-42 聚集程度。在 Aβ 誘導的細胞毒性實驗中，PC12 細胞接種於 96 孔板中，以各藥液處理細胞 24 小時，以 30 μmol·L-1 薑黃素處理細胞 3 小時為陽性對照，加入 10 μmol·L-1 聚集的 Aβ1-42（已在 37 ℃孵育 4 天）處理細胞 24 小時，以 MTT 法測定細胞存活率。
2.2.6 總 RNA 提取與反轉錄[編輯]
將經過給藥處理的 RAW264.7 細胞進行總 RNA 提取及反轉錄：接種於 12 孔板的細胞 , 每孔加入 300 μL 的 RNAzol RT Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)，並在 4 ℃下震盪 30 分鐘後以 13000 r·min-1 的轉速離心 15 分鐘，取上清 , 75% 的乙醇洗三遍後，將 RNA 溶於無核酸酶水中，並測定其濃度（Nanodrop 2000）。取 3 μg 總 RNA，根據要求（Invitrogen）進行反轉錄：在 20 μL 體系中，先加入 3 μg 總 RNA，1 μL oligo-dT (500 μg·L-1)，1 μL dNTP (10 mmol·L-1)，用水補齊至 12 μL 後在 65℃下孵育 5 分鐘；繼續加入 2 μL dithiothreitol（DTT，0.1 mol·L-1），1 μL 的 RNaseOUT（40 U·μL-1） 和 4 μL 5×First Strand Buffer，在 37℃下孵育 5 分鐘；最後加入 1 μL Moloney Murine Leukemia Virus （MMLV），充分混勻後在 37 ℃下孵育 50 分鐘，後轉入 70 ℃下孵育 15 分鐘。
2.2.7 實時熒光定量 PCR[編輯]
取等量的上述反轉產物，使用 SYBR Green Mix 進行實時熒光定量 PCR。本實驗中通過 Roche 480 multiplex quantitative PCR 儀測定 TNF-α 和 IL-6 的相對表達量，並以 GAPDH 作為內參基因。引物序列分別為：TNF-α: 上游引物為 5』-AGT GAC AAG CCT GTA GCC-3』， 下 游 引 物 為 5』-AGG TTG ACT TTC TCC TGG3』；IL-6： 上游引物 5』-GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GC-3』，下游引物 5』-CTA CAT TTG CCG AAG AGC CCT CAG G-3』；GAPDH：上游引物 5』-AAC GGA TTT GGC CGT ATT GG-3』，下游引物 5』-CTT CCC GTT CAG CTC TGG G-3』。擴增條件為：95 ℃預變性 3 分鐘；95 ℃變性 10 秒，60 ℃退火 20 秒，72 ℃延伸 30 秒，45 個循環。ΔΔCt 法分析基因的相對表達量。
2.2.8 統計學處理[編輯]
數據以平均數 ± 標準差 (x ± s) 表示，採用 GraphPad Prism 統計分析軟件進行單因素方差分析或 t 檢驗，其中 *p <0.05，**p <0.01，***p<0.001。
3 結果
3.1 不同前處理的 SBP 藥液對 PC12 細胞分化的影響
通過 MTT 實驗我們得到了四種不同前處理 SBP 的最佳給藥終濃度，分別為 500 μg·mL-1（水提液）、100 μg·mL-1（醇提液）、100 μg·mL-1 (SBP-DMSO)和 25 μg·mL-1（SBP-SGF）。具體方式為：SBP 水提液母液（100 mg·mL-1）以 1∶200的體積比加入到細胞培養基中，得到細胞給藥終濃度為 500 μg·mL-1；SBP 醇提液母液（100 mg·mL-1）以 1∶1000 的體積比加入到細胞培養基中，得到細胞給藥終濃度為 100 μg·mL-1；SBP-DMSO 母液（500 mg·mL-1）先用 DMSO稀釋至 100 mg·mL-1，再以 1:1000 的體積比加入到細胞培養基中，得到細胞給 藥 終 濃 度 為 100 μg·mL-1；SBP-SGF 母 液（100 mg·mL-1） 先 稀 釋 至 25 mg·mL-1，再以 1∶1000 的體積比加入到細胞培養基中，得到細胞給藥終濃度為 25 μg·mL-1。
用 NGF（50 ng·mL-1）處理的 PC12 細胞會停止分裂並進行終末分化，此模型被廣泛地用於研究神經元分化過程。通過觀察形態學變化，與對照組相比，50 ng·mL-1 的 NGF 可顯著誘導 PC12 細胞分化，即促進細胞軸突生長；低濃度的 NGF（1.5 ng·mL-1）則無法誘導 PC12 細胞軸突生長；不同前處理的 SBP 單獨處理，也可不同程度地誘導 PC12 細胞軸突生長（圖 1-A）。而比較圖 1-A 中各種藥液單獨處理組和各藥液與 NGF 共同處理組可以發現，不同前處理的 SBP可協同 1.5 ng·mL-1 NGF 顯著地促進 PC12 細胞軸突生長。此結果在對神經軸突長度的統計結果中也得到了證明（圖 1-B）。
3.2 不同前處理 SBP 對 Aβ1-42 誘導的細胞毒性的抑制作用
通過 MTT 法測定細胞存活率的實驗結果發現，不同前處理的 SBP 藥液均可在一定程度上逆轉由聚集的 Aβ1-42 對 PC12 細胞所產生的毒性作用，PC12 細胞存活率顯著升高（圖 2），其中 Curcumin 作為陽性對照。
3.3 不同前處理的 SBP 藥液的抗炎作用[編輯]
為了探索 SBP 的抗炎作用，我們應用 RAW264.7 細胞建立炎症模型：以不同前處理的 SPB 藥液預處理細胞 5 小時 , 並設置溶劑對照（DMSO 及 SGF 均控制在體積比 0.1% 以下）及陽性對照組（Dexamethason，地塞米松，以下簡稱DEX），後加入 LPS（100 ng·mL-1）誘導炎症，繼續培養 12 小時後收集細胞。通過相對定量 PCR 的方法對炎症因子（TNF-α，IL-6）mRNA 水平的變化進行了檢測。如圖 3 所示，經 LPS 誘導後的 RAW264.7 細胞的炎症因子表達水平均顯著高於溶劑對照組，表明炎症模型構建成功。
本實驗結果表明，除了經 SGF 前處理的 SBP 之外（圖 3-D），其他前處理的 SBP 藥液均具有顯著的抗炎作用，具體表現為炎症因子 TNF-α 及 IL-6 的 mRNA 表達水平與 LPS 模型組相比顯著下降（圖 3A-C）。註：與模型組相比，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001。
4 討論
麝香保心丸在治療冠心病心絞痛方面的應用已十分廣泛［6］［7］。本研究發現，在神經保護及抗炎方面，麝香保心丸同樣具有良好潛能。具體表現為，對神經細胞軸突生長具有促進作用，且能部分逆轉 Aβ 聚集引起的神經細胞毒性，能夠顯著下調炎症因子 TNF-α 和 IL-6 表達水平。同時，為了更好地研究SBP 對老年痴呆等神經損傷的作用，本研究還關注了不同前處理方法對 SBP 的神經保護及抗炎作用的影響，試圖尋找一種最為合理且效果顯著的前處理方法，以更好地進行分子細胞水平的研究。
麝香保心丸主要成分包括人參、冰片、麝香、牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥。雖然目前對於麝香保心丸在老年痴呆症的影響方面的研究有限，但其各組成成分在神經退行性疾病中的作用已有報道。人參作為一種天然藥物已被研究證明具有良好的神經保護作用，尤其是在神經退行性疾病方面，通過維持體內平衡，抗炎，抗氧化，抗凋亡和免疫激活等方式發揮其在神經退行性疾病中的療效［8］。已有研究表明，服用人參後的阿爾茲海默病人表現出了明顯提高的認知水平，具體表現在對認知測試 ADAS 和 MMSE 分數的提高，但是在停止服用人參後，改善的 ADAS 和 MMSE 分數又恢復到了對照組水平［9］。另有研究表明，麝香能夠改善長期壓力引起的小鼠記憶損傷及神經退行性病變［10］。除此之外，麝香、冰片能夠迅速透過血腦屏障而直接作用於中樞神經系統，具有增強腦組織耐缺氧的能力及抗腦水腫等作用，能夠減輕對神經細胞的損傷，表現出對腦的保護作用［11］［12］［13］。劉亞敏等人在對 58 例缺血性中風的臨床觀察表明，早期使用芳香開竅法，可改善患者意識障礙［14］。從中我們得到啟發，麝香保心丸對老年痴呆症等神經退行性疾病應具有療效。一般認為，神經退行性疾病是神經元不斷喪失結構和功能的過程，伴隨着一系列細胞和分子水平的變化。而本研究中我們得出了麝香保心丸對神經軸突生長的促進作用，這為之後更深入地研究分子機制提供了理論依據。
神經炎症反應因子被發現於一系列的神經損傷疾病中而得到廣泛關注。研究表明，由膠質細胞產生的一些細胞因子，如白介素 -6（IL-6）等可抑制神經發生，這些細胞因子可引發神經炎症，大多數神經系統疾病又與神經炎症有關，暗示了這些疾病的共同發病機制可能是神經炎症引起的神經發生抑制［15］。因此對於麝香保心丸的神經保護作用還應從炎症方面進行佐證。同樣，在本研究中我們驚喜地發現麝香保心丸具有較好的抗炎效果。雖然本研究應用的炎症模型細胞為 RAW264.7 細胞系，其並非神經細胞，但從一定程度上亦可為我們接下來的研究提供理論依據。
本研究採用了幾種不同的前處理方式進行 SBP 的神經保護及抗炎效果的研究。為了能夠儘可能多地保留 SBP 的藥效成分，我們應用萬能溶劑 DMSO 對藥物進行溶解，得到 SBP-DMSO 藥液，此藥液也表現出良好的神經保護與抗炎作用。為了更好地模擬人體接觸吸收 SBP 的過程，應用人工胃液 SGF 溶解 SBP 以模擬機體對藥物的消化作用，但是結果表明 SGF 處理後的 SBP 並未表現出抗炎作用；SBP 的水提液與醇提液則分別集中關注了藥物中水溶性成分和醇溶性成分在研究中的作用效果，結果表明這兩種成分單獨作用時均表現出良好的神經保護及抗炎作用。應用不同的前處理方式，本研究試圖儘可能全面地反映 SBP 在神經保護及抗炎方面的影響，並得到了較為客觀的結果。
本研究結果提示：麝香保心丸具有神經保護及抗炎潛能，是一個值得期待的抗神經退行性疾病的中藥。但是由於神經退行性疾病病因複雜，潛伏期較長，麝香保心丸作為一味多成分中成藥，仍需進行更加深入的病理及臨床研究觀察。本研究還得出，不同前處理的麝香保心丸表現出不同療效，這可能與溶劑的極性等因素相關，這為將來麝香保心丸治療神經退行性疾病在分子細胞水平的研究提供了參考。
參考文獻
［1］Young A B．Four decades of neurodegenerative disease research：how far we have come［J］．The Journal of Neuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience，2009，29（41）：12722-12728. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3767-09.2009
［2］Glenner G G，Wong C W．Alzheimer's disease：initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein［J］．Biochem Biophys Res Commun，1984，120（3）：885-90. https://doi.org/10.1016/S0006-291X(84)80190-4
［3］Bartus R T，Johnson J R，Eugene M．Clinical tests of neurotrophic factors for human neurodegenerative diseases，part 1：where have we been and what have we learned?［J］．Neurobiology of disease，2017，97：156-168． https://doi.org/10.1016/j.nbd.2016.03.027
［4］Schain M，Kreisl W C．Neuroinflammation in neurodegenerative disorders-a review［J］．Current Neurology and Neuroscience Reports，2017，17（3）：25． https://doi.org/10.1007/s11910-017-0733-2
［5］陳文超，鍾森，王家寧，等．麝香保心丸對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織 Bcl-2、Caspase-3 表達的影響［J］．中國中醫急症，2008（10）：14211446．
［6］彭建華．麝香保心丸聯合單硝酸異山梨酯治療心絞痛 32 例［J］．長江大學學報（自科版），2018，15（24）：19-20． ［7］沈琴．麝香保心丸治療冠心病心絞痛患者的效果研究［J］．中西醫結合心血管病電子雜誌，2018，6（35）：165-166． ［8］Cho I H．Effects of Panax ginseng in neurodegenerative diseases［J］．Journal of Ginseng Research，2012，36（4）：342． https://doi.org/10.5142/jgr.2012.36.4.342
［9］Lee S T，Chu K，Sim J Y，et al．Panax ginseng enhances cognitive performance in Alzheimer disease［J］．Alzheimer Disease & Associated Disorders，2008，22（3）：222-226．https://doi.org/10.1097/WAD.0b013e31816c92e6
［10］Galal A E W M，Ali S S，Ayuob N N．The role of musk in relieving the neurodegenerative changes induced after exposure to chronic stress［J］． American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias，2018，33（4）：221-231．https://doi.org/10.1177/1533317518755993
［11］朱秀媛，高益民，李世芬．人工麝香的研製［J］．中成藥，1996（7）：38-41．https://doi.org/10.1016/S0262-1762(99)80763-9
［12］王斌，曹慧，沈甜，等．麝香、冰片對大鼠腦缺血再灌注急性期和恢復早期炎性損傷的保護作用及機制研究［J］．中藥材，2015，38（10）：2139-2143．
［13］劉亞敏，張賜安，徐秋英，等．麝香、冰片對全腦缺血再灌注大鼠腦組織氨基酸類神經遞質的影響［J］．中藥新藥與臨床藥理，2002（4）：231-233．
［14］劉亞敏，沈強，徐秋英．麝香保心丸合中醫辨證治療急性缺血性中風的臨床療效分析［J］．中成藥，2006（1）：52-55．
［15］Prokop S，Miller K R，Heppner F L．Microglia actions in Alzheimer's disease［J］. Acta Neuropathologica，2013，126（4）：461-477. https://doi.org/10.1007/s00401-013-1182-x
