2.2.5 β- 淀粉样蛋白 42 (Aβ1-42) 聚集和神经毒性测定
将终浓度为 10 μmol·L-1 的 Aβ1-42 与各药液溶于水中，以 30 μmol·L-1姜黄素为阳性对照，在 37 ℃下孵育 4 天。将 10 μL 样品与 190 μL 硫磺素 T（ThT）溶液（5 μmol·L-1）混合，通过 EnVisionTM Multilabel Reader 测量荧光强度，从而测定 Aβ1-42 聚集程度。在 Aβ 诱导的细胞毒性实验中，PC12 细胞接种于 96 孔板中，以各药液处理细胞 24 小时，以 30 μmol·L-1 姜黄素处理细胞 3 小时为阳性对照，加入 10 μmol·L-1 聚集的 Aβ1-42（已在 37 ℃孵育 4 天）处理细胞 24 小时，以 MTT 法测定细胞存活率。
2.2.6 总 RNA 提取与反转录
将经过给药处理的 RAW264.7 细胞进行总 RNA 提取及反转录：接种于 12 孔板的细胞 , 每孔加入 300 μL 的 RNAzol RT Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)，并在 4 ℃下震荡 30 分钟后以 13000 r·min-1 的转速离心 15 分钟，取上清 , 75% 的乙醇洗三遍后，将 RNA 溶于无核酸酶水中，并测定其浓度（Nanodrop 2000）。取 3 μg 总 RNA，根据要求（Invitrogen）进行反转录：在 20 μL 体系中，先加入 3 μg 总 RNA，1 μL oligo-dT (500 μg·L-1)，1 μL dNTP (10 mmol·L-1)，用水补齐至 12 μL 后在 65℃下孵育 5 分钟；继续加入 2 μL dithiothreitol（DTT，0.1 mol·L-1），1 μL 的 RNaseOUT（40 U·μL-1） 和 4 μL 5×First Strand Buffer，在 37℃下孵育 5 分钟；最后加入 1 μL Moloney Murine Leukemia Virus （MMLV），充分混匀后在 37 ℃下孵育 50 分钟，后转入 70 ℃下孵育 15 分钟。
2.2.7 实时荧光定量 PCR
取等量的上述反转产物，使用 SYBR Green Mix 进行实时荧光定量 PCR。本实验中通过 Roche 480 multiplex quantitative PCR 仪测定 TNF-α 和 IL-6 的相对表达量，并以 GAPDH 作为内参基因。引物序列分别为：TNF-α: 上游引物为 5’-AGT GAC AAG CCT GTA GCC-3’， 下 游 引 物 为 5’-AGG TTG ACT TTC TCC TGG3’；IL-6： 上游引物 5’-GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GC-3’，下游引物 5’-CTA CAT TTG CCG AAG AGC CCT CAG G-3’；GAPDH：上游引
